Células-Tronco de Chefe (ou simplesmente Células de Chefe) são itens permanentes que aumentam a dificuldade do jogo quando ativas. A primeira é adquirida derrotando a Mão do Rei, a RainhaTQatS ou o Drácula - Forma FinalRtC sem nenhuma Célula-Tronco de Chefe ativa, a segunda vencendo qualquer um deles com pelo menos uma ativa e assim por diante. No entanto, a quinta Célula-Tronco de Chefe só é obtida derrotando o GiganteRotG com quatro delas ativas. O uso de Aspectos impede a aquisição da próxima Célula-Tronco de Chefe.
As Células-Tronco de Chefe podem ser injetadas e removidas no início do jogo no Tubo, desde que a pessoa não tenha saído da área inicial. Cada uma torna o jogo significativamente mais difícil, aumentando o nível, a densidade e a variedade de inimigos e limitando as opções de cura. Por outro lado, níveis de dificuldade mais elevados também aumentam as células deixadas por inimigos e o nível da Forja Lendária, e permitem o acesso a novas portas de bônus espalhadas pelos níveis e projetos, bem como alguns que são deixados por inimigos exclusivos de CTCs altos. As portas de bônus mostram o número de Células-Tronco de Chefe necessárias para entrar e brilharão em azul se um número suficiente delas estiverem ativas no momento.
Quando as Células-Tronco de Chefe, então chamadas Runas de Chefe, foram adicionadas no patch v0.5.3 na Foundry Update, todas elas podiam ser obtidas na dificuldade 0 CTC e cada uma era deixada por um chefe diferente.